Sofora, Sophora Alopecuroides

PAYLAŞIN

Sophora Alopecuroides ‘in Ekstraksiyon ve  İzolasyon Alkaloitlerinin H22 Tümör Taşıyıcı Farelerde Anti Tümör Etkileri

AiHua Chang,1,# Zhen Cai,2,# ZhiHong Wang, 1 ve ShengKai Sun1

Go to:

 

Background

Alkaloids of Sophora alopecuroides have good biological activity, and are widely used in clinical settings, which not only have pharmacological activities of anti-cancer, cancer suppression, as well as the inhibition, and killing of various microorganisms; but also possess extensive pharmacological effects on immune system, nervous system and cardiovascular system. The objective of this paper was to extract and isolate total alkaloids of Sophora alopecuroides (TASA), and to study their anti-tumor effects in H22 tumor-bearing mice.

Materials and Methods

TASA were extracted and isolated using thin-layer chromatography, and column chromatography; and the isolated compounds were analyzed using nuclear magnetic resonance. The inhibitory effects of TASA on tumor in H22-bearing mice were determined by MTT assay.

Results

Three compounds were isolated from Sophora alopecuroides L., which were matrine, oxymatrine and sophoridine, respectively. Meanwhile, mouse H22 sarcoma model was established and different doses of TASA apparently inhibited solid H22-tumor in mice; it inhibited the thymus, and spleen to some extent; the degree of inhibition was more obvious for the spleen.

Conclusion

TASA has an anti-tumor effect in H22 tumor-bearing mice.

Keywords: Sophora alopecuroides L., H22 tumor-bearing mice, matrine, oxymatrine and sophoridine

Giriş
Çin ilacı Ku Dou Zi (Sophora alopecuroides L.) Fabaceae familyasından Sophora türüne ait bir bitkidir; ayrıca Ku Shen Cao, Ku Dou Gen, Ku Gan Cao, Xi Dou Gen, Ku Dou Cao, Ou Ku Shen, vs isimlerine sahiptir. Tadı acıdır, doğası soğuktur, ısı giderici, detoksifiye edici, patojenik rüzgar dağıtıcı; rutubet giderici, analjezik, böcek öldürücü, anti-bakteriyel ve anti-enflamatuar etkileri vardır (Yang ve ark., 1998Ren., 2000). Temel olarak Merkezi Asya bölgesi, Kuzey Çin ve Çin'in Kuzeybatı çöl bölgesinde yayılmaktadır; ıssız tuz bataklıklarında veya tuzlu-alkali topraklarda büyümektedir ve kuraklığa, tuzluluğa ve alkaliliğe yüksek tolerans ile karakterize olmuştur.

Son yıllarda Sophora alopecuroides L. hakkındaki araştırmaların sayısı artmaktadır. Sophora alopecuroides'in alkaloidleri iyi biyolojik etkinliğe sahip olup klinik sahalarda yaygın şekilde kullanılmaktadır; farmakolojik anti-kanser, kanser-baskılama etkinliklerinin yanı sıra çeşitli mikro organizmaların inhibe edilmesini ve öldürülmesini sağlar, ayrıca bağışıklık sistemi, sinir sistemi ve kardiyovasküler sistem üzerinde kapsamlı farmakolojik etkilere sahiptir. Araştırmalara göre TASA'nın geniş yelpazeli anti-bakteriyel etkinliği vardır ve hepatom SMMC-7721, hücrelerinin apoptozunu indükleyebilir (Ye ve ark., 2009Zhang ve ark., 2005). Bu araştırmada Sophora alopecuroides L.'nin tohumundaki alkaloid kimyasal bileşimleri araştırılmıştır; üç bileşim tohumdan izole edilmiştir: matrine, oxymatrine ve sophoridine. Bu esnada, anti-tümör eetki ve mekanizmalarının incelemesi için ve farelerde H22-tümörünün büyümesine dair TASA'nın inhibe edici etkilerini gözlemlemek için fare H22 sarcoma modeli teşkil edilmiştir.

Materyaller Ve Yöntemler

Enstrümanlar ve tıbbi materyaller

VORIAN-600, nükleer manyetik rezonans spektrometresi (dahili standart olarak TMS); Shimadzu UV-2401 UV-görünür bölge spektrofotometresi (Shimadzu Corporation, Japonya); ince-katmanlı  kromotografi için silika jeli, kolon kromotografisi için silika jeli, ve kolon kromotografisi için alumina, Qingdao Haiyang Chemical Co., Ltd.; ve tüm diğer reaktifler analitik sınıftan kullanılmıştır. Sophora alopecuroides L. ham ilaç olarak Shenyang tıp pazarından alınmış ve Yunnan Üniversitesi'nden Prof. Qiguo Wu tarafından Fabaceae familyasından Sophora türünden Sophora alopecuroides L. olarak tanımlanmıştır.

Sophora alopecuroides alkaloidlerinin kimyasal bileşenlerinin izolasyonu ve tanımlanması
Özütlenmesi ve izolasyonu

5kg Sophora alopecuroides L. kaba toz (10–20 elek) olarak tartıldı, %5 NaOH çözeltisine 4 katı hacmi ile eklendi, gece boyunca ıslatıldı, alkali sıvısı atıldı, kalıntı %5 sülfürik asit çözeltisi ile daha da özütlendi, özüt ardından bir katyon değişimi reçinesinden geçirildi; eluent %95 idi, etanolda %3 amonyak vardı, eluentler kombine edildi, etanol geri kazanıldı, ardından karbon adsorpsiyonu etkinleştirildi, toplamda 312g alkaloid elde edildi, ardından nötr alumina kolonu ile izole edildi, çeşitli elüsyon fraksiyonları sağlamak için petrol eter-aseton ile gredyen, solventle ayrıştırıldı. Her bir fraksiyon kombine edildi ve üç bileşim elde etmek için tekrar kristalleştirildi.

 

Yapısal Tespiti

Bileşik 1:

beyaz bir kolon şeklinde kristaller  az çözünen petrol eteri çerisinde  metanol, kloroform, aseton ile çözünür .C15H24N2O, m.p 81–83°C, aşağida anlatildiği gibi: 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 2.08 (1H, m, 2Ha), 2.82 (1H, m, 2He), 1.95 (1H, m, 3Ha), 1.45 (1H, m, 3He), 1.46-1.36 (m, 4Ha), 1.95 (m, 4He), 1.78-1.55 (m, 6H), 1.78-1.55 (m, 6H), 1.78-1.55 (m, 7H), 1.47-1.36 (m, 8H), 1.82 (m, 9Ha), 1.43-1.34 (m, 9He), 2.11 (m, 10Ha), 2.82 (m, 10He), 3.83 (dt, J=9.6, 6.0Hz), 1.52 (m, 12Ha), 1.97 (m, 12He), 1.76-1.54 (m, 13H), 2.22 (m, 14Ha), 2.45 (m, 14He), 3.08 (t, J=12.6Hz, 17Ha), 4.42 (dd, J=12.6, 4.2Hz, 17He); 13C-NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 57.4 (C-2), 21.3 (C-3), 27.3 (C-4), 35.4 (C-5), 63.9 (C-6), 41.2 (C-7), 26.7 (C-8), 20.9 (C-9), 57.3 (C-10), 53.3 (C-11), 27.8 (C-12), 19.1 (C-13), 32.8 (C-14), 169.5 (C-15), 43.3 (C-17) Yukarıdaki spektroskopik verileri ve literatürdeki verileri karşılaştırarak (Song ve ark., 2008), bileşik  olarak tespit edilmiştir. yapısı Şekil 1’de gösterilmiştir.

 

Şekil 1

Matrine

beyaz bir kolon şeklinde kristaller  az çözünen petrol eteri çerisinde  metanol, kloroform, aseton ile çözünür .C15H24N2O, m.p 81–83°C, aşağida anlatildiği gibi: : 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 2.15 (m, 2Ha), 2.84 (m, 2He), 2.05 (m, 3Ha), 1.84-1.42 (m, 3He), 1.84-1.42 (m, 3He), 1.92 (m, 4He), 2.03 (m, 5H), 1.84-1.40 (m, 6H), 1.84-1.40 (m, 7H), 1.84-1.40 (m, 8H), 1.07 (m, 9Ha), 2.19 (m, 10Ha), 2.83 (m, 10He), 3.46-3.25 (m, 11H), 1.84-1.41 (m, 12Ha), 1.92 (m, 12He), 1.85-1.40 (m, 13H), 2.39 (m, 14H), 3.47-3.25 (m, 17H); 13C-NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 55.8 (C-2), 23.7 (C-3), 28.3 (C-4), 30.4 (C-5), 63.4 (C-6), 41.1 (C-7), 21.7 (C-8), 21.9 (C-9), 50.3 (C-10), 55.6 (C-11), 30.4( C-12), 19.1 (C-13), 32.5 (C-14), 169.6 (C-15), 47.3 (C-17). Yukarıdaki spektroskopik verileri ve literatürde verileri karşılaştırarak Tabanlı (Li et al., 2004), bileşik olarak tespit edilmiştir. yapısı Şekil 2’de gösterilmiştir.

 

Şekil 2

 

 

Sophoridine

Kompleks 3: beyaz bir kolon şeklinde kristaller  az çözünen petrol eteri çerisinde  metanol, kloroform, aseton ile çözünür .C15H24N2O, m.p 81–83°C, aşağida anlatildiği gibi: : 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 3.11 (m, 2H), 2.72 (m, 3Ha), 1.87-1.53 (m), 1.86-1.53 (m, 4H), 1.86-1.53 (m, 5H), 3.10 (m, 6H), 1.86-1.54 (m, 7H), 1.86-1.54 (m, 8H), 2.06 (m, 8He), 2.71 (m, 9H), 3.12 (m, 10H), 5.13 (dt, J=10.2, 5.4Hz, 11H), 1.27 (m, 12Ha), 2.24 (m, 12He), 1.86-1.53 (m, 13H), 2.25 (m, 14Ha), 2.48 (m, 14He), 4.21 (t, J=12.6Hz, 17Ha), 4.42 (dd, J=12.6, 5.4Hz, 17He); 13C-NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 69.4 (C-2), 17.3 (C-3), 26.4 (C-4), 34.4 (C-5), 67.5 (C-6), 42.2 (C-7), 24.7 (C-8), 17.9 (C-9), 69.3 (C-10), 53.1 (C-11), 28.8 (C-12), 18.8 (C-13), 32.9 (C-14), 170.2 (C-15), 41.3 (C-17).  Yukarıdaki spektroskopik verileri ve literatürde verileri karşılaştırarak Tabanlı (Li et al., 2004), bileşik olarak tespit edilmiştir. yapısı Şekil 2’de gösterilmiştir.

 

 

şekil 3

Oxymatrine

Farelerde H22 hepatom üzerinde TASA'nın inhibe edici etkileri üzerine araştırma

Materyaller ve enstrümanlar

TASA (kendiliğinden hazır), 5-floroürosil enjeksiyonu (Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Co., Ltd. parti numarası: 0500326). Kunming fareleri, vücut ağırlığı (20±2.0)g, yarısı erkek yarısı dişi ( Çin Tıp Üniversitesinden satın alınmıştır); fare H22 hepatom hücre hatları (China Medical University-Çin Tıp Üniversitesi tarafından sağlanmaktadır).

Deney yöntemleri

Fareler beş farklı grup olarak rastgele hale getirilmiştir (n=10/grup), yani normal kontrol grubu; 5-FU grubu [15 mg/(kg·d)]; ve TASA düşük-, orta-, ve yüksek doz grupları (50, 100, ve 200 mg/kg). Tüm deneysel prosedürler Hayvanlarda Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylıdır.

Modelin teşkili ve yönetim süreci

12 gün boyunca H22 hepatom assit tümörü aşılanmış olan ve iyi büyüyen tümörlere sahip tümörlü fareler seçilmiş ve servikal dislokasyon ile feda edilmiştir; assitik sıvı çekilmiştir, normal tuza sahip bir 5×107hücre/mL konsantrasyonu ile bir hepatom hücre süspansiyonuna seyreltilmiştir, ve steril koşullar altındaki farelerin sağ ön koltuk altına deri altından aşılanmıştır. Aşılamadan 24 saat sonra her bir grupta steril intraperitoneal veriliş başlamıştır; her bir fareye yedi ardışık gün boyunca günlük 0.2mL ilaç verilmiştir. Son verilişten 24 saat sonra fareler tartılmıştır ve servikal dislokasyon ile feda edilmiştir, ayrıca tümör kütlesi, dalak ve timüs çıkartılmış ve tartılmıştır. Ve tümör büyüme inhibisyon oranları hesaplandı. Tümor inhibisyon oranı = [(kontrol grubunun ortalama tümör ağırlığı -tedavi grubunun ortalama tümör ağırlığı) / kontrol grubunun ortalama tümör ağırlığı] × %100.

İstatistiksel analiz

Her grubun verileri  x±s olarak ifade edilmiştir, istatistiksel analiz t-testi ve varyans testi ile yapılmıştır.

Deney sonuçları

Tümörlü farelerde TASA'nın anti-tümör etkileri

Sonuçlar Tablo. 1'de gösterilmektedir. Farklı TASA doz gruplarının hepsi görünüşe göre katı H22 tümörlerini inhibe etmiştir. Negatif kontrol grubu ile kıyaslandığında her bir gruptaki tümör ağırlıkları azaltılmış olup, farklar ciddidir. Farelerde katı H22 tümörü üzerinde TASA'nın inhibe edici etkisi (x±s, n=10)

Tümörlü farelerde bağışıklık organlarında TASA'nın etkisi

Kontrol grubuyla kıyaslandığında düşük-dozlu TASA grubu farelerinde timüs endeksinde ciddi değişiklik yokken dalak endeksi ciddi oranda azalmıştır (P<0.01); yüksek dozlu TASA grubu farelerinin timüs ve dalak endeksleri kontrol grubundan düşüktü, dalak endeksi azalması ciddi şekilde farklıydı (P<0.01), bu göstergelere göre TASA'nın farelerde timüs ve dalak üzerinde bazı inhibe edici etkileri vardı ve inhibisyon derecesi dalak için çok daha belirgindi.

Tartışma
Yaşam streslerindeki artış ve yaşam çevresinin bozulması ile kötü huylu tümörler insan sağlığının tehdit edilmesinde önemli bir faktör haline gelmiştir. İnsanların kanser hakkında farkındalığının derinleşmesiyle kanserin teşhisi ve tedavisi, geleneksel "bul ve yok et (genelde cerrahi, radyoterapötik ve kemoterapötik yollar kullanılarak)" şeklinde olmaktan çıkıp, "hedefleme ve kontrol etme"; fiili kontrol mekanizmaları ve tümör önlemenin keşfedilmesi; ve yüksek seviyede hedefli, düşük toksisite sahibi anti-neoplastik ilaçların arayışı haline dönüşmüştür (Zhang ve ark., 2004Jiang ve ark., 2000Yu ve ark., 2004).

Çin bitkisel ilaçları yavaş etkili, çoklu kanallı ve çok hedefli vs. olarak karakterize olmakta olup, hem belirtileri hem de tümör hücrelerinin inhibisyonu veya öldürülmesiyle kök sebepleri tedavi etmede ya da kanser hastalarında postoperatif düzenlemelerin desteklenmesinde bir rol sahibi olabilir. Bu deneyde, TASA'nın yapısal karakteristiklerine bağlı olarak özütleme için asidik koşullar kullanılmıştır, gredyen elüsyonu petrol eter-aseton ile gerçekleştirilmiştir ve üç kimyasal bileşen (matrine, oxymatrine ve sophoridine) her bir fraksiyonun tanımlanmasıyla izole edilmiştir.

Bu araştırmada H22 hücreleri, laboratuvar ortamında gelişimi TASA'nın inhibe edici etkileri MTT analiziyle gözlemlenmiştir, farklı TASA doz gruplarının hepsinin görünüşe göre farelerde katı H22 tümörünü inhibe etmiş olabileceği bulunmuştur, ve TASA'nın inhibe edici etkisi ilaç konsantrasyonundaki artışla kademeli olarak artmış olup açıkça bir doz-etki ilişkisi sunmaktadır, deney sonuçları rapor edilmiş literatür ile tutarlı haldedir (Huang ve ark., 2002;Hong ve ark., 2008Huang ve ark., 2001).

Bu araştırma, TASA'nın anti-tümör etkisini in vivo olarak gözlemlemek için fare H22-tümör modelini kullanmıştır. Araştırmaya göre TASA'nın farelerde katı H22 tümörünün büyümesinde görülür inhibe edici etkisi olup, tümör inhibisyon oranı %50'nin üzerine ulaşmıştır ve TASA'nın bir antineoplastik ilaç olarak potansiyel klinik uygulaması değerini  göstermektedir.

 

şekil 4

Tümör taşıyan farelerin immün organları üzerinde ki TASA ‘nın etkileri.

Kaynaklar;

1. Hong G, Liu P X, Shen X. Inhibition of Sophora alopecuoride Alkaloid Derivative SPRIDA on H22 Liver Cancer of Mice. Herald of Medicine. 2008;27(4):369–371.

2. Huang X M, Li B. Review on the Pharmacology Study of Alkaloids from Sophora alopecuroides L. Chinese Pharmaceutical Affairs. 2002;16(3):175–178.

3. Huang X M, Li B, Shen L Z. Inhibitory Effects of Four Alkaloids of Sophora alopecuroides on TNF α production by Murine Peritoneal Macrophages. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica.2001;17(3):12–14.

4. Jiang Y X, Yu J Q, Peng J Z. The Inhibitory Effects of Oxymartrine on Central Nervous System in Mice.Journal of Ningxia Medical University. 2000;22(3):157–158. 162.

5. Li K, Wang Y L, Zhu H Q. Determination of Three Kinds of Alkaloids in Kudouzi by HPLC. Northwest Pharmaceutical Journal. 2004;19(2):53–54.

6. Ren D. Development and Clinical Application of compounded Sophora alopecuroides Oral Ulcer Composite film. Chinese Traditional Patent Medicine. 2000;22(8):590–591.

7. Song Y Q, Wei Y H, Liu W J. Simultaneous Determination of Sophoridine, Matrine and Sophocarpine inSophora alopecuroides Cream by HPLC. China pharmacy. 2008;19(24):1878–1879.

8. Yang J X, Yu Z F. Research Progress of Sophora alopecuroides L. Tianjin Pharmacy. 1998;10(1):43–45.

9. Ye G, Ma C H, Huang X Y, Li Z X, Huang C G. Components of Sophora alopecuroides Seeds. Chemistry of Natural Compounds. 2009;45(4):545–546.

10. Yu Y Q, Ding P L, Chen D F. Determination of Quinolizidine Alkaloids in Sophora Medicinal Plants by Capillary Eectrophoresis. Analytica Chimica Acta. 2004;523:15–20.

11. Zhang W M, Pu. P, Zhang D G. Studies on Extraction of Alkaloids in Seeds of Sophora alopecuraides L.Chinese Agricultural Science Bulletin. 2005;(21):7–9.

12. Zhang M J, Huang J. Recent Research Progress of Anti-tumor Mechanism of Matrine. China Journal of Chinese Materia Medica. 2004;27(2):115–118. [PubMed]

 

Yazar Hakkında

İbrahim Gökçek

Bitkisel materyaller genelde kurutulur ve bu şekilde bir yıl muhafaza edilebilirler. Bitkilerin kurutulması için özel odalar tutulur ve kurumaları beklenir. Bikiler yağmurlu ve sisli havada toplanmamalı ve ıslatılmamalıdır. Bu onun küflenmesine yol açabilir.

Yorum Gönderİn